DNA合成简介:

Oligo DNA的人工化学合成始于50年代初期,1980年,全自动的固相DNA合成仪面市后,使得快速、高效合成Oligo DNA成为可能,这极大地推动了生物工程技术的蓬勃发展。随着生物工程技术发展,人工合成Oligo DNA的需求量越来越大,已经成为分子生物学实验中最基础的试剂之一。

DNA合成技术在生命科学领域应用极为广泛,如PCR扩增、 DNA 杂交、基因合成及 DNA 测序等。欧谱公司提供的Oligo DNA制品具有如下特点:


1. 国际先进的DNA合成仪:Dr.Oligo-192系列,为客户提供快捷、优质的产品;
2. 引物质量保证:使用进口高品质合成试剂进行生产, HPLCPAGE OPC质检及纯化;
3. 发货周期短:常规引物在2个工作日以内、修饰引物在5个工作日以内;
4. 可完成多种类型的引物修饰及标记。




DNA合成的原理:

现在一般都采用亚磷酰胺化学合成Oligo DNA片段,具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该方法是在固相载体上完成DNA链的合成的,合成时从3'→5'方向进行,通常3'端的第一个碱基结合在Glass担体(Controlled Pore GlassCPG)上。Oligo DNA合成的原理基本相同,主要差别在于合成产率的高低、试剂消耗量和单个循环用时的不同。我公司采用的合成仪主要机型为Dr.Oligo-192高通量合成仪。

合成的详细过程见图1,现简要说明如下:


1 Oligo DNA合成原理图。N1代表第一个碱基,N2代表第二个碱基,依次类推。

第一步,三氯乙酸和预先连接在固相载体(CPG)上的第一个核苷酸反应(其活性基团处于被保护状态),脱去核苷酸5'-羟基的保护基团DMT,获得游离的5'-羟基;

第二步,活化新的碱基单体(Phosphoramidite),准备与第一个碱基进行反应;

第三步,合成DNA的原料(亚磷酰胺保护的核苷酸单体)与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的3'端被活化,5'-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应;

第四步,带帽(capping)反应,缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在纯化时分离掉;

第五步,在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。(即将三价磷氧化成五价磷)

(重复进行Step1Step5的循环,直至合成完所需的Oligo DNA序列)

第六步,合成结束后,将Oligo DNA分子从CPG上切下,再进行进一步的纯化。

合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。连接在CPG上的引物被切下来,通过OPCPAGE等手段纯化引物,成品引物用C18浓缩、脱盐,测定OD260定量,根据定单要求分装。

常用的纯化方法有: C18 柱、OPC 柱、 PAGE HPLC 。本公司暂时不提供 HPLC 纯化。

OPC纯化:采用OPCOligonucleotide Purification Cartridge)纯化,是根据 DNA 保护基(DMTr基)和Cartridge 柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的 DNA 片段,可以去除杂质,如氨、盐和短片段,该制品纯度大于95%。此级别制品可用作PCR引物、DNA测序引物及各种探针等。该级别只提供长度在40mer(不含40mer)以下的合成DNA制品。

[注]:OPC纯化完全可以满足杂交、测序、探针、常规PCR等用途。

PAGE纯化:采用PAGEPolyacrylamide Gel Electrophoresis)纯化,是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对DNA片段进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA的方法。该制品纯度大于95% 对长链Oligo DNA (大于45mer)的纯化特别有效 对实验要求比较高的如RT-PCR引物、各种探针,或用于PCR克隆测序、定点突变等,建议选用PAGE纯化制品。






DNA合成项目表:

(一)常规合成(< 60bp

(二)长链合成(60-89bp

(三)硫代修饰

(四)特殊碱基


(五)荧光修饰


(六)双标记荧光探针

(七)其他标记及修饰

(八)几种标记的吸收波长和反射波长及颜色对照表


(九)简并碱基代码表



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